Крейг Вентер - Расшифрованная жизнь. Мой геном, моя жизнь
Мы могли бы использовать этот способ комплементарного соединения оснований, применив два подхода к определению генетического кода адреналинового рецептора. Во-первых, использовать небольшую часть последовательности белкового рецептора, полученную нами для расшифровки соответствующей последовательности ДНК, в качестве зонда для поиска определенных генов в геноме человека. Во-вторых, воспользоваться наследием эволюции: гены адреналинового рецептора индюшки и человека, скорее всего, должны быть довольно схожими. Другими словами, мы могли бы сделать ДНК-зонды из самого гена индюшки, – если они свяжутся с комплементарными ДНК человека, они выявят эквивалентный ген человека. Помещая радиоактивную метку на разные виды зондов, мы таким образом установили бы место присоединения каждого из меченых зондов.
Но, как обычно, возникли проблемы. Нужно было получить геном человека в форме, пригодной для этих экспериментов. Даже в виде хромосом, то есть в том виде, в котором он находится в клетках, размер этого кода слишком велик для исследований. Для успешной «охоты на гены» необходимо разделить генетический код человека на пригодные для работы участки. Если взять полный набор ДНК в клетке человека и разделить его на части, то в итоге получится то, что ученые называют «библиотекой». Существуют два основных типа библиотек ДНК – геномные и клоновые.
Геномная библиотека ДНК создается с помощью специальных ферментов, называемых рестриктазами, которые разрезают хромосомы человека на мелкие кусочки, каждый из них состоит примерно из 15–20 тысяч пар оснований ДНК. Чтобы изучать эти части ДНК человека, нужно уметь их копировать и хранить, точно так же, как книги – печатать и переплетать. В процессе копирования каждый фрагмент ДНК человека прикрепляется к ДНК бактериофага – вирусу, который инфицирует бактерии и размножается внутри них. Такой обработанный бактериофаг, несущий в себе ДНК человека, используют для инфицирования бактерии кишечной палочки E. coli. Если налить в чашку Петри бульон с инфицированной кишечной палочкой E. coli, то на бактериальном газоне появятся стерильные пятна – там, где вирусы убили E. coli. Эти пятна, бляшки, содержат миллионы вирусных частиц – и следовательно, миллионы копий фрагментов ДНК человека.
Клоновые библиотеки ДНК составляют на основе другого генетического материала в клетках – матричной (информационной) РНК, переносящей геномную информацию для сборки белка. Только 3 % нашего генетического кода отвечает за кодирование белков, поэтому мы получаем гораздо более компактный «рабочий чертеж» ДНК человека, если сосредоточим внимание на РНК, кодирующую эти белки. (Типичный ген может содержать миллион пар оснований, а длина «отредактированной» РНК может доходить всего лишь до тысячи пар оснований.) Другими словами, такая библиотека ДНК использует тот же способ, с помощью которого природный «издатель» превращает весь генетический код в гораздо меньшие матричные РНК – лишь субпопуляции генов, необходимых для создания специфичных клеток или тканей.
По своей природе матричная РНК недолговечная и нестабильная молекула, в противном случае мы бы просто выделили ее из клетки и прочитали. Однако с помощью фермента «обратная транскриптаза» РНК нетрудно скопировать в стабильную молекулу ДНК. Это называется комплементарной ДНК или кДНК. Выделяя РНК человека для изготовления кДНК, мы получаем сжатый, легко читаемый вариант генома с кодирующими белок генами.
Как и в геномной библиотеке, каждый том комплементарной библиотеки должен быть представлен в удобном для обработки и копирования виде. Природа решила и эту проблему. Комплементарные библиотеки ДНК получают путем выделения матричных РНК в тканях, преобразуют эти РНК в комплементарные фрагменты ДНК и встраивают их в плазмиды, небольшие кольцевые молекулы ДНК с инструкциями для бактерии. Бактерии кишечной палочки E. coli, инфицированные этой кДНК, играют роль «печатного станка» книг для этой библиотеки. Каждая бактерия содержит соответствующий сегмент кДНК человека, и когда бактерия реплицируется (делится на дочерние клетки), то и материнские, и дочерние клетки получают одинаковые фрагменты гена человека.
Эти фрагменты ДНК невидимы для невооруженного глаза, но их легко разглядеть с помощью специальных приборов. На дно чашки Петри наносят очень тонким слоем, чтобы по возможности избежать соприкосновения колоний бактерий, бульон с E. coli, содержащими кДНК человека. Отдельные колонии бактерий начинают расти, и когда они в итоге становятся различимы глазом в виде пятен, в каждой из них оказываются миллионы идентичных бактериальных клеток (клонов), и в каждой из этих клеток находится одинаковая часть кДНК человека. В небольшой чашке Петри можно получить десятки и сотни тысяч таких изолированных колоний и создать обширную библиотеку ДНК человека.
С помощью любой из таких библиотек мы начинаем охоту на рецептор, используя способ крепления комплементарных ДНК. Фильтровальной бумагой удаляем ДНК из чашек Петри с E. coli, вырастившей геномную или комплементарную библиотеку ДНК. Фильтровальную бумагу затем замачиваем на ночь в растворе рецепторного ДНК-зонда. Чтобы определить, связан ли он с комплементарной ДНК в библиотеке, зонд метят радиоактивным изотопом фосфора Р-32, заменяя им некоторые атомы фосфора в молекуле ДНК. Затем фильтры промывают, чтобы удалить все следы радиоактивного зонда, которые не присоединились ни к одному из фрагментов ДНК, сушат и помещают на несколько дней в кассету с рентгеновскими пленками. Положительные колонии и бляшки – области, где радиоактивный зонд прикрепился к целевой ДНК-мишени, видны на проявленной рентгеновской пленке как черные пятна. Сравнивая пятна на пленке с пятнами в чашке Петри, положительные колонии или бляшки можно идентифицировать, а затем выделить и амплифицировать их ДНК.
Заметим, что найти нестабильную матричную РНК, кодирующую определенные белки, не так-то просто. В каждой клетке есть всего несколько тысяч молекул трудно выделяемых мембранных белков, например адреналиновых рецепторов. Как следствие, невелико также и количество матричной РНК, кодирующей рецепторный белок. Используя генетический материал мозга человека, полученный для медицинских исследований, нам приходилось изучать более миллиона колоний кДНК, чтобы найти именно ту, которая содержала матрицу для создания адреналинового рецептора. Мы вырастили колонию для производства достаточного количества такой ДНК и с ее помощью сумели ее секвенировать – определить порядок расположения четырех нуклеотидов (C, G, A и T), формирующих звенья в молекуле ДНК с внешним остовом из сахара и фосфата. Порядок расположения пар оснований в ДНК определяют с помощью двух основных методов секвенирования. Один из них был разработан в Лаборатории молекулярной биологии Совета по медицинским исследованиям в Кембридже Фредериком Сенгером, блестящим ученым, (кстати, разделяющим мою любовь к парусному спорту){15}, который однажды сказал, что «у него все в порядке с головой, но не очень хорошо с болтовней». Второй был описан гарвардским ученым Уолли Гилбертом, известным как «серый кардинал с грандиозными замыслами». В 1980 году Гилберт и Сенгер получили Нобелевскую премию. Большинство экспериментов по секвенированию, проведенных в последние десятилетия, являются прямым продолжением именно метода Сенгера, которому удалось разрешить некоторые сложнейшие проблемы биологии. В мае 1975 года Сенгер потряс научный мир, частично секвенировав ДНК, а затем впервые полностью секвенировав геном вируса: 5375 пар оснований генетического кода бактериофага phi-X174. Позднее Сенгер секвенировал приблизительно 17 тысяч (или около того) пар оснований ДНК митохондрий человека (энергетических фабрик наших клеток), положив начало первому проекту по расшифровке генома человека.
Метод расшифровки ДНК, впервые предложенный в Кембридже Сенгером совместно с Аланом Коулсоном, состоит в создании многочисленных копий молекул ДНК с использованием фермента ДНК-полимеразы. Для репликации ДНК этой полимеразой ее помещают в раствор из нуклеотидов – строительных блоков ДНК. Фермент считывает информацию с каждого конца первичной нити ДНК, используя нуклеотиды для создания новых копий. Вклад Сенгера состоял в добавлении в этот раствор дополнительного ингредиента – «нуклеотидов-терминаторов», помеченных радиоактивным P-32. Эти нуклеотиды присоединяются к растущей копии и случайным образом прекращают действие полимеразы, помечая конец растущей цепи радиоактивной меткой. Поскольку это может происходить на любой стадии образования в пробирке множества копий молекул ДНК, в результате образуется смесь фрагментов ДНК различной длины, каждый из которых оканчивается радиоактивно помеченными C, G, А или T, – смотря по тому, какое основание помечено P-32.
